محیط کشت کورن میل آگار ایبرسکو

توضیحات

محیط کشت میکروبی کورن میل آگار حاوی آرد ذرت بستر مناسبی برای تولید کلامیدوسپور به وسیله کاندیدا است. در نگهداری وذخیره سازی کشت های قارچی بویژه قارچ های تولید کننده پیگمان سیاه به کار می رود. در ادامه به این میپردازیم که محیط کشت کورن میل آگار چیست؟ طرز تهیه­ ی آن و کاربرد آن چگونه است.

محیط کشت کورن میل آگار چیست؟

محیط کشت کورن میل آگار ایبرسکو، که توسط هازن و رید ابداع شد، یک محیط ساده و عمومی حاوی آرد ذرت است که برای کشت مخمر‌ها و کپک‌ها استفاده می‌شود.Corn meal agar باعث رشد ساختار‌های مختلف مورفولوژی میکروسکوپی توسط مخمر‌ها می‌شود؛ که به شناسایی آن‌ها کمک می‌کند.
دو محقق به نام‌های Pollack و Benham به این نتیجه رسیدند که این محیط کشت برای مطالعه‌ی مورفولوژی کاندیدا هم کاربرد دارد.پس از آن‌ها دو پژوهشگر دیگر به نام‌های Walker و Huppert این محیط را با افزودن تویین ۸۰، اصلاح کردند و این کار آن‌ها منجر به سریع‌تر شدن شبیه‌سازی‌ها و تشکیل بسیاری از کلامیدوسپور‌های انواع کاندیدا‌ها شد.

فرمول کورن میل آگار بسیار ساده است که فقط شامل کورن میل و آگار است  و حاوی مواد مغذی کافی جهت رشد قارچ است. تویین ۸۰ هم ترکیبی از استر‌های اولئیک است که منجر به فعالسازی تولید کلامیدوسپور بوسیله‌ی Candida albicans، Candida stellatoides و Candida tropicalis می‌شود.
در این ترکیب کورن میل اینفیوژن تأمین‌کننده‌ی نیتروژن، ویتأمین‌ها، مواد معدنی و آمینو اسید‌های ضروری جهت رشد است. آگار هم عامل جامد‌کننده است.

طرز تهیه­ ی محیط کشت کورن میل آگار

– ۱۷گرم از پودر را در یک لیتر آب مقطر حل کنید.

– آن را بجوش برسانید تا کاملاً بصورت محلول در بیاید.

– پی اچ را روی ۰٫۲±۶ در دمای ۲۵ درجه تنظیم کنید.

– با اتوکلاو کردن در دمای ۱۲۱ درجه و به مدت ۱۵ دقیقه آن را استریل کنید.

– محیط آماده باید در دمای ۲ الی ۸ درجه و همچنین محیط پودری باید در دمای ۱۵ الی ۳۰ درجه نگهداری شود.

ترکیبات محیط کشت کورن میل آگار بر حسب گرم برلیتر:

• عصاره کورن میل ۲ گرم
• آگار ۱۵ گرم
• پی اچ نهایی باید روی ۰٫۲±۶ و در دمای ۲۵ درجه سانتیگراد تنظیم شود.

پروسه ی تست کورن میل آگار

۱- بگذارید پتری دیش‌ها در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد یا دمای اتاق گرم شوند و سطح آگار قبل از کشت خشک شود.

۲- پلیت‌های کشت میکروبی را بردارید.

۳- با استفاده از سوزن کشت، قسمت چسبی قابل مشاهده ارگانیسم را بدست‌آورید. سوزن را داخل آگار فرو کنید و دو خط عمود بصورت \”X\” ایجاد کنید.

۴- یک لامل را آتش بزنید و بگذارید تا خنک شود. سپس آن را بر روی سطح منطقه‌ی \”X\” قرار دهید تا تنش آن با اکسیژن کاهش یابد. با کاهش فشار اکسیژن، تولید کلامیدوسپور تحریک می‌شود. بخشی از سطح کشت داده شده را بدون پوشش بگذارید.

۵- پلیت را با استفاده از نوار یا MycoSeals مهر و موم کرده و تا ۷۲ ساعت در تاریکی به صورت هوازی در دمای اتاق (۲۵-۳۰ درجه سانتیگراد) انکوب کنید و بصورت روزانه رشد کلنی‌ها و مورفورلوژی را بررسی کنید.

۶- پلیت را وارونه کنید و با استفاده از لوپ ۱۰برابر بصورت میکروسکوپی بررسی کنید. طول لبه‌ی لامل را مشاهده کنید و تا تشکیل کلومیدوسپور را تشخیص دهید.

۷- مراحل یک تا شش روش فوق را برای بررسی اسپور شدن کپک‌ها دنبال کنید. انکوبه کنید تا کپک قابل مشاهده شود و لامل را در گلایسین قرار دهید.

۸- از نظر میکروسکوپی، ساختار‌های ویژه را بررسی کنید.

نکات کلیدی در مورد محیط کشت کورن میل آگار ایبرسکو

1.  افزودن تویین ۸۰ (به عنوان مثال ۱% ) به محیط کشت کورن میل آگار تا حد زیادی رشد کلامیدوسپورها را در محیط افزایش میدهد.
2. مکنیزی دریافت که تمام ۱۶۳ جزء کاندیدا آلبیکانس که از آزمایشگاه های انگلستان به دست آمده اند به تولید کلامیدوسپورها بر روی اکسید کورن میل آگار منجر شده اند اما داوسون با استفاده از  تنها ۲۷ جزء از کاندیدا آلبیکانس دریافت که اکسید چاپکس آگار و rice infusion agar اندکی برای تولید کلامیدوسپور بهتر است.
3.  یک پتری دیش حاوی کورن میل آگار جهت شناسایی ۴ یا ۵ کلنی مختلف کاندیدا که بر روی سابرودکستروز آگار رشد کرده اند به کار می رود.
4. با استفاده از یک خط مستقیم یک کلنی را از سطح پلیت جداکنید و یک شکاف عمیق در کورن میل آگار ایجاد کنید. (یعنی یک شیار افقی)
5. این کار را برای هر کلنی تکرار کنید.
6. یک لامل آتش زده ی استریل را بر روی خط کشت قرار دهید.
7. پس از انکوباسیون به مدت ۲۴ تا ۴۸ ساعت در دمای ۲۲ درجه سانتیگراد، خطوط کشت بصورت میکروسکوپی مورد بررسی قرار بگیرند. این کار از بوسیله ی لامل و یک لنز شیئی ضعیف انجام شود.
8. در امتداد چنین خطوطی، کاندیدا آلبیکانس خوشه های توپی مانند سلولهای جوانه دار مای سلیوم و کلامیدوسپورهای دارای دیواره ضخیم منحصر بفرد تولید می کند.
9. کورن میل آگاری که مکمل آن گلوکز باشد، هرگز نباید برای تولید کلامیدوسپور مورد استفاده قرار بگیرد.
10.  محیط کشت کورن میل آگار با تویین ۸۰ به Candida stellatoides و Candida tropicalis امکان تولید کلامیدوسپورها را میدهد.
11.  برخی از سویه های کاندیدا پس از کشت های مکرر توانایی تولید کلامیدوسپورها را از دست می دهند.

تفسیر نتایج

با استفاده از بزرگ نمایی کم، وجود سلول‌های جوانه‌زده، هیف‌ها، بلاستوسپور‌ها و کلامیدوسپور‌ها را بررسی کنید. بیشتر سویه‌های C. albicans و C. stellatoidea بعد از ۲۴-۴۸ ساعت انکوباسیون، کلامیدوسپور‌های معمولی تشکیل می‌دهند. این کار را بصورت روزانه تا ۴ روز تکرار کنید. همچنین C. dubliniensis کلامیدوسپور‌ها را تشکیل می‌دهد.

سویه های کنترل

سخن پایانی

محیط کشت میکروبی کورن میل آگار حاوی آرد ذرت بستر مناسبی برای تولید کلامیدوسپور به وسیله کاندیدا است که یک معیار معتبر و قابل قبول برای شناسایی گونه های کاندیدا است. همانطور که در بالا گفتیم ترکیبات محیط کشت کور میل عصاره کردن کورن و آگار است.